細胞培養(yǎng)那些事兒

1. 俗語道，到什么山上唱什么歌，不同細胞用不同的培養(yǎng)液。此時，就不得不提起培養(yǎng)基里的“四大金剛”—MEM、DMEM、1640、F-12，它們基本參與了90%以上種類細胞的培養(yǎng)過程。 MEM作為帶頭大哥，能力非常，號稱是應(yīng)用全的細胞培養(yǎng)液。 DMEM作為隨時緊跟老大MEM的二弟，青出于藍而勝于藍，濃度要高出2~4倍，可分為高糖型（含葡萄糖4500mg/L）和低糖型（含葡萄糖1000mg/L）。 老三1640中規(guī)中矩，營養(yǎng)成分比較簡單，比DMEM少一點糖和谷光甘肽，常用于淋巴細胞的培養(yǎng)。 小兄弟F12常用來支持CHO、Hela和L－細胞生長以及原代大鼠肝細胞和前列腺上皮細胞的培養(yǎng)。MEM和F12 這兩種培養(yǎng)基各取1/2，即可形成神經(jīng)生物學(xué)通用的培養(yǎng)基。 

2. 細胞生長的空間密度是細胞培養(yǎng)的關(guān)鍵。具體養(yǎng)細胞時應(yīng)該摸索細胞喜歡的生長空間密度，既不能讓細胞瓶里的細胞因擁擠不堪而萎靡不振；也不能讓細胞濃度低于1~5×10^5個/mL而導(dǎo)致“孤獨死”（因為細胞的健康生長需要細胞間的連接）。因而細胞接種前，要先通過細胞計數(shù)來調(diào)整細胞濃度。 

3. 當(dāng)培養(yǎng)的貼壁細胞形態(tài)不好時，可在傳代時，先倒掉舊的培養(yǎng)基，加入3ml新的培養(yǎng)基（有無血清都可以）洗滌一次，用滴管吸走，再加入3ml培養(yǎng)基，沿著瓶底輕輕吹打一遍，然后吸走。這時在正式進行消化、吹打。 其次，把吹打下的細胞懸液加入到含有新培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶內(nèi)，置于培養(yǎng)箱里培養(yǎng)，按時間點觀察細胞貼壁情況（10min，20min，30min）。而后迅速倒出其中的培養(yǎng)基，加入3ml新培養(yǎng)基再輕輕洗一次，然后加入完全培養(yǎng)基培養(yǎng)并觀察細胞生長情況以及形態(tài)。直至找到細胞完美的形態(tài)為止。 

4. 至于在培養(yǎng)瓶中加入多少培養(yǎng)基量，則是需要實驗汪們自己去摸索的。對于生長快的細胞，易生長的細胞加少一點培養(yǎng)基，細胞形態(tài)會更好，但是要注意對換液時間的把握。

 5. 如何選擇培養(yǎng)瓶。一般，生長速度慢的細胞如果想要更漂亮的細胞狀態(tài)，那么采用塑料瓶會比玻璃瓶的效果好；生長速度快的細胞，用玻璃瓶培養(yǎng)的效果會更好。因此，對于同一種細胞，在其生長速度慢的時候（比如細胞剛復(fù)蘇時或者原代培養(yǎng)），塑料瓶會好一點；而在其生長旺盛的時候，玻璃瓶則相對會好一點。

 6. 細胞凍存時，蓋子要擰緊，不然復(fù)蘇水浴時會滲水，造成細胞污染。因而凍存管要選擇原配的管子和蓋子（不同牌子、型號的管子會有差別），蓋子擰緊后好用封口膜封住。且每支凍存管都要標(biāo)上細胞的名稱、凍存時間，并記錄在冊，以免后續(xù)復(fù)蘇細胞時，取錯細胞。

 7. 細胞凍存時要嚴格進行梯度降溫（-4℃→-20℃~-40℃→-80℃→液氮）。要知道冰火兩重天的生活環(huán)境只會讓嬌弱的細胞自爆身亡，謹記：緩降溫！但如果真心趕時間時，可以使用細胞凍存盒進行細胞凍存，而后盡快將其轉(zhuǎn)入液氮中。此外，要定期測量液氮罐里的液氮儲備，以保證細胞全部浸在液面下。

 8. 細胞解凍時，由于凍存管管壁較厚、隔熱，而導(dǎo)致水浴時間太長（2min還沒融化）時，可以將水浴鍋的溫度調(diào)至40℃左右，可以縮短解凍時間。

 9. 提前預(yù)定超凈臺，減少復(fù)蘇后插在冰盒里等待的時間，可避免細胞房人滿為患，超凈臺使用緊張，復(fù)蘇1h后，還沒有加入新的培養(yǎng)液。（高濃度DMSO防止胞內(nèi)形成冰晶，凍存時保護細胞，但復(fù)蘇融解后，浸泡時間太久會對細胞有毒性） 

10. 復(fù)蘇細胞時一定要有耐心，因為有些細胞在復(fù)蘇一星期后才會真正有起色。因而，盡管細胞在復(fù)蘇三四天后沒有任何動靜，也不要輕易倒掉所有細胞，要耐心等待，兩周后再做決定。