細(xì)胞凍存和復(fù)蘇以及細(xì)胞培養(yǎng)簡(jiǎn)介

細(xì)胞培養(yǎng)是指將細(xì)胞從動(dòng)物或植物體內(nèi)取出，然后在適宜的人工環(huán)境中生長(zhǎng)的過(guò)程。細(xì)胞可以在培養(yǎng)前直接從組織中取出并通過(guò)酶或機(jī)械方法進(jìn)行解離，也可以來(lái)源于已建立的細(xì)胞系或細(xì)胞株。

原代培養(yǎng)原代培養(yǎng)是指細(xì)胞從組織中分離出來(lái)后，在適宜條件下增殖，直到它們占據(jù)所有可用的基質(zhì)（即達(dá)到匯合狀態(tài)）的培養(yǎng)階段。在此階段，必須通過(guò)將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含有新鮮生長(zhǎng)培養(yǎng)基的新容器中進(jìn)行繼代培養(yǎng)（即傳代），以為其提供更多的繼續(xù)生長(zhǎng)空間。

細(xì)胞系第一次傳代培養(yǎng)后，原代培養(yǎng)物即被稱(chēng)為細(xì)胞系。來(lái)自于原代培養(yǎng)的細(xì)胞系壽命有限，隨著細(xì)胞的傳代，生長(zhǎng)能力最強(qiáng)的細(xì)胞會(huì)占據(jù)優(yōu)勢(shì)，最終導(dǎo)致細(xì)胞群體在基因型和表型上達(dá)到一定程度的均一性。?

細(xì)胞株如果通過(guò)克隆或其他方法從培養(yǎng)物中陽(yáng)性篩選出了細(xì)胞系的亞群，則該細(xì)胞系成為一個(gè)細(xì)胞株。與親代細(xì)胞系起始時(shí)相比，細(xì)胞株通常會(huì)獲得一些其他的遺傳學(xué)改變。

那么在細(xì)胞培養(yǎng)之前，我們先簡(jiǎn)單講以下細(xì)胞凍存與復(fù)蘇。

細(xì)胞凍存與復(fù)蘇

當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)狀況較好或者代數(shù)較早時(shí)，需及時(shí)大量的凍存。

細(xì)胞凍存液比例為培養(yǎng)基：血清：DMSO=7:2:1，也可血清：DMSO=9:1。細(xì)胞凍存密度通常為1-3×106個(gè)/ml。細(xì)胞凍存采用慢凍方式，減少冰晶形成，避免細(xì)胞損傷。通常4℃放置0.5 h，-20℃放置2 h，-80℃冰箱中過(guò)夜，取出凍存管，移入液氮容器內(nèi)。

細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)升溫要快，防止在解凍過(guò)程中水分進(jìn)入細(xì)胞，形成冰晶，影響細(xì)胞存活。38℃水浴不時(shí)搖動(dòng)，在1分鐘內(nèi)使其完全融化，1000rpm離心5min,棄去上清，用新鮮培養(yǎng)基重懸移入培養(yǎng)瓶中。

下面，我們講一下細(xì)胞的培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)作為生物實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)操作，在各位研究僧的日常中占著相當(dāng)大的分量。細(xì)胞培養(yǎng)的好，實(shí)驗(yàn)事半功倍。

污染防控

細(xì)胞培養(yǎng)最基本的是做好污染防控，包括微生物污染的防控和細(xì)胞系間交叉污染的防控。

實(shí)驗(yàn)中需保持良好的操作習(xí)慣，所用材料的位置擺放要順手，污染源和已滅菌物品要分開(kāi)放置。實(shí)驗(yàn)室也需定期清潔與消毒。

細(xì)胞培養(yǎng)瓶

目前商品化的細(xì)胞培養(yǎng)瓶主要為瓶蓋是否帶氣孔兩種。其中不帶透氣孔細(xì)胞培養(yǎng)瓶擰緊后需適當(dāng)回旋瓶蓋，保證CO2能順利進(jìn)入細(xì)胞培養(yǎng)瓶。

細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，對(duì)于適應(yīng)能力強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞，可在傳代3-4次后更換新的細(xì)胞培養(yǎng)瓶。對(duì)于非腫瘤細(xì)胞系如293T，HEK293等細(xì)胞，建議每次傳代更換新的細(xì)胞培養(yǎng)瓶來(lái)保證細(xì)胞狀態(tài)。

血清與培養(yǎng)基

通常血清的添加比例為10%，當(dāng)然也可根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)和生長(zhǎng)速率適當(dāng)增加或減少添加比例。在更換血清品牌或者批次時(shí)，最好需對(duì)血清的品質(zhì)進(jìn)行驗(yàn)證，防止對(duì)實(shí)驗(yàn)造成影響。

對(duì)于培養(yǎng)基，目前商品化的比較成熟，穩(wěn)定性也較好。如若需自配培養(yǎng)基時(shí)，過(guò)濾前攪拌時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)（培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)豐富，細(xì)菌常溫下20min就可繁殖一代，其代謝產(chǎn)物會(huì)對(duì)培養(yǎng)基的品質(zhì)產(chǎn)生影響）。培養(yǎng)基過(guò)濾除菌后，應(yīng)對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行無(wú)菌驗(yàn)證，防止污染。

細(xì)胞傳代

正常細(xì)胞形態(tài)較好，輪廓清晰，邊緣透亮，細(xì)胞增殖狀況良好。當(dāng)貼壁細(xì)胞長(zhǎng)到密度90%時(shí)，需進(jìn)行傳代。

傳代時(shí)通常使用胰酶消化法。該方法又分為干消化法和濕消化法。

干消化法：胰酶浸潤(rùn)后棄去胰酶，待細(xì)胞變圓后加入新鮮培養(yǎng)基吹下后再進(jìn)行細(xì)胞傳代。

濕消化法：待細(xì)胞變圓，肉眼觀(guān)察下成流沙狀脫落時(shí)即可加入新鮮培養(yǎng)基終止消化，1000rpm離心5min,棄去上清，用新鮮培養(yǎng)基重懸傳代。

吹打細(xì)胞時(shí)，手法要輕柔，避免吹打出氣泡，造成細(xì)胞因內(nèi)外壓差破裂，同時(shí)需避免刮到瓶壁影響細(xì)胞的貼壁。

不同細(xì)胞的貼壁能力不同，消化時(shí)間不同；不同細(xì)胞細(xì)胞間連接強(qiáng)度不一樣，消化時(shí)間不同；同一細(xì)胞生長(zhǎng)狀狀況不同，消化時(shí)間不同。消化時(shí)適時(shí)觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)，避免因過(guò)度消化影響細(xì)胞活性。

傳代間隔時(shí)間和傳代比例因細(xì)胞而異。細(xì)胞傳代過(guò)程中，當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)狀態(tài)不好或者污染時(shí)及時(shí)棄去細(xì)胞，重新復(fù)蘇。