無需熒光標(biāo)記的細(xì)胞分選方案

在細(xì)胞分選實驗中，熒光標(biāo)記雖為常用手段，但可能帶來細(xì)胞活性影響、非特異性結(jié)合干擾、操作流程繁瑣等問題。無需熒光標(biāo)記的細(xì)胞分選方案，依托細(xì)胞自身物理特性、生物物理特征或特異性親和作用，避開熒光標(biāo)記步驟，既能簡化操作流程，又能保留細(xì)胞天然狀態(tài)，適配對標(biāo)記敏感或樣本量有限的實驗場景。這類方案并非單一技術(shù)，而是涵蓋多種原理的多元化選擇，需根據(jù)細(xì)胞類型、分選目標(biāo)與實驗條件靈活適配。

一、基于物理特性的分選：利用細(xì)胞固有屬性實現(xiàn)分離

細(xì)胞的大小、密度、折射率等物理特性存在天然差異，這類方案通過精確捕捉這些差異，無需額外標(biāo)記即可實現(xiàn)分選，關(guān)鍵優(yōu)勢是操作溫和、對細(xì)胞損傷小。

利用不同細(xì)胞在流體或梯度介質(zhì)中的沉降速度差異實現(xiàn)分離。常用方法包括密度梯度離心與微流控尺寸篩選、密度梯度離心。

適用場景與注意事項

適用于細(xì)胞大小或密度差異明顯的場景，如分離成熟細(xì)胞與未成熟細(xì)胞、血細(xì)胞與組織細(xì)胞碎片。操作時需注意：離心轉(zhuǎn)速與時間需嚴(yán)格控制，避免過高轉(zhuǎn)速導(dǎo)致細(xì)胞擠壓損傷；微流控芯片需提前驗證孔徑適配性，防止通道堵塞或目標(biāo)細(xì)胞遺漏。

細(xì)胞的折射率與周圍介質(zhì)存在差異，當(dāng)激光照射時會產(chǎn)生不同的散射信號，這類方案通過檢測散射光信號控制分選閥門，實現(xiàn)無標(biāo)記分離。部分流式細(xì)胞儀可開啟 “無標(biāo)記模式”，只依靠前向散射光（FSC，反映細(xì)胞大小）與側(cè)向散射光（SSC，反映細(xì)胞內(nèi)部復(fù)雜度）信號，圈定目標(biāo)細(xì)胞群體并啟動分選。例如分離淋巴細(xì)胞與單核細(xì)胞，可通過 FSC/SSC 散點圖區(qū)分兩類細(xì)胞的信號集群，無需熒光標(biāo)記即可完成分選。

適用場景與注意事項

適用于細(xì)胞形態(tài)或內(nèi)部結(jié)構(gòu)差異較大的場景，如免疫細(xì)胞亞群初步分離、細(xì)胞與雜質(zhì)碎片的分離。需注意：這類方案的分選純度依賴細(xì)胞物理特性差異的明顯程度，若目標(biāo)細(xì)胞與雜細(xì)胞的散射信號重疊，需結(jié)合其他方案優(yōu)化；分選前需確保細(xì)胞懸液分散均勻，避免聚團導(dǎo)致信號誤判。

二、基于生物物理特性的分選：捕捉細(xì)胞電化學(xué)或力學(xué)差異

細(xì)胞的介電特性、聲學(xué)特性等生物物理特征具有特異性，這類方案通過電場、聲場等外部作用，放大這些差異實現(xiàn)分選，適配對純度要求較高的無標(biāo)記場景。

    利用細(xì)胞在非均勻電場中的介電響應(yīng)差異實現(xiàn)分離。不同細(xì)胞的膜電容、細(xì)胞質(zhì)電導(dǎo)率不同，在交變電場中會產(chǎn)生不同方向的介電泳力：目標(biāo)細(xì)胞向電場強度高的區(qū)域移動（正介電泳），雜細(xì)胞向電場強度低的區(qū)域移動（負(fù)介電泳），通過設(shè)計電極陣列引導(dǎo)細(xì)胞運動軌跡，完成分選。實驗需借助介電電泳分選芯片，通過調(diào)整電場頻率、電壓強度優(yōu)化分選效果。

適用場景與注意事項

適用于細(xì)胞介電特性差異明顯的場景，如活細(xì)胞與死細(xì)胞分離、不同類型微生物分離。操作時需注意：電場參數(shù)需根據(jù)細(xì)胞類型預(yù)實驗優(yōu)化，避免過高電壓導(dǎo)致細(xì)胞膜損傷；樣本懸液的電導(dǎo)率需與芯片適配，可通過添加適量電解質(zhì)調(diào)整。

利用超聲波在流體中形成的駐波場，對細(xì)胞產(chǎn)生周期性的聲學(xué)輻射力。不同大小、密度的細(xì)胞受到的聲學(xué)輻射力不同，會被推向駐波場的波腹或波節(jié)位置，結(jié)合微流控芯片的流體導(dǎo)向設(shè)計，實現(xiàn)細(xì)胞分離。例如在芯片通道中產(chǎn)生垂直于流體方向的超聲駐波，目標(biāo)細(xì)胞被推向通道中心并隨主流收集，雜細(xì)胞被推向通道兩側(cè)并分流排出。

適用場景與注意事項

適用于對離心或電場敏感的細(xì)胞，如干細(xì)胞、脆弱的腫瘤細(xì)胞系。優(yōu)勢是無接觸、無損傷，可實現(xiàn)高通量分選。需注意：超聲功率與頻率需精確控制，避免功率過高導(dǎo)致細(xì)胞活性下降；通道內(nèi)流體流速需與聲學(xué)輻射力匹配，確保分選效率。

三、基于特異性親和的無熒光分選：依托生物分子相互作用實現(xiàn)富集

這類方案利用細(xì)胞表面天然表達的特異性標(biāo)志物與親和配體的結(jié)合作用，無需熒光標(biāo)記，直接通過親和捕獲實現(xiàn)分選，兼顧特異性與操作便捷性。

將針對細(xì)胞表面標(biāo)志物的特異性抗體偶聯(lián)至磁珠表面（磁珠無熒光標(biāo)記），與細(xì)胞懸液混合后，抗體與目標(biāo)細(xì)胞表面標(biāo)志物結(jié)合，形成 “磁珠 - 細(xì)胞” 復(fù)合物。將混合液置于磁場中，復(fù)合物會被磁場吸附，棄去上清液中的雜細(xì)胞，洗脫后即可獲得目標(biāo)細(xì)胞。例如分離 CD4+T 細(xì)胞，可使用偶聯(lián) CD4 抗體的無熒光磁珠，通過磁場捕獲實現(xiàn)富集。

適用場景與注意事項

適用于已知目標(biāo)細(xì)胞特異性表面標(biāo)志物的場景，分選純度高于物理分選方案。操作時需注意：磁珠與細(xì)胞的比例需優(yōu)化，避免磁珠過量導(dǎo)致非特異性結(jié)合；洗脫步驟需溫和，可通過加入競爭性配體或調(diào)整緩沖液 pH 實現(xiàn)磁珠與細(xì)胞分離，減少磁珠殘留。

將特異性配體（如抗體、抗原、凝集素等）固定于層析柱或芯片表面，當(dāng)細(xì)胞懸液流經(jīng)時，目標(biāo)細(xì)胞通過表面標(biāo)志物與配體特異性結(jié)合而被截留，雜細(xì)胞則隨洗脫液流出；后續(xù)通過改變緩沖液成分（如增加離子強度、加入競爭性試劑），使目標(biāo)細(xì)胞與配體分離并被洗脫收集。例如利用植物凝集素與紅細(xì)胞表面糖蛋白的特異性結(jié)合，可實現(xiàn)紅細(xì)胞與其他血細(xì)胞的分離。

適用場景與注意事項

適用于大規(guī)模細(xì)胞分選或高純度富集需求，如干細(xì)胞分選、特定免疫細(xì)胞純化。需注意：配體固定需牢固，避免洗脫過程中配體脫落污染細(xì)胞；洗脫條件需精確優(yōu)化，確保目標(biāo)細(xì)胞完全洗脫且活性不受影響。

四、不同方案的選擇依據(jù)與常見問題排查

若細(xì)胞物理特性差異明顯、對純度要求不高：優(yōu)先選擇密度梯度離心或微流控尺寸篩選，操作簡單、成本較低；若需高通量、低損傷分選：聲學(xué)分選或介電電泳分選更適配，尤其適合活細(xì)胞后續(xù)培養(yǎng)或功能實驗；若已知目標(biāo)細(xì)胞特異性標(biāo)志物、對純度要求高：無熒光免疫磁珠分選或親和層析分選更優(yōu)，特異性強、富集效果穩(wěn)定；若樣本量少、需快速分選：微流控類方案（尺寸篩選、聲學(xué)分選）更適合，樣本損耗小、操作周期短。

分選純度不足：若因細(xì)胞特性差異不明顯導(dǎo)致，可組合兩種方案（如先密度梯度離心初步富集，再用親和分選進一步純化）；若因非特異性結(jié)合導(dǎo)致，可在分選前用封閉液（如 BSA、血清）處理樣本，減少雜細(xì)胞吸附；細(xì)胞活性下降：多因操作強度過大導(dǎo)致，需降低離心轉(zhuǎn)速、優(yōu)化電場 / 超聲參數(shù)，或在緩沖液中加入細(xì)胞保護劑（如谷胱甘肽、血清）；分選效率低：可能是目標(biāo)細(xì)胞占比過低或分離條件不適配，可先通過預(yù)處理（如過濾、洗滌）去除雜質(zhì)，或調(diào)整介質(zhì)密度、電場頻率等關(guān)鍵參數(shù)。

無需熒光標(biāo)記的細(xì)胞分選方案，關(guān)鍵是 “順應(yīng)細(xì)胞天然特性” 或 “依托特異性生物相互作用”，避開熒光標(biāo)記帶來的潛在問題。從物理特性分選的溫和便捷，到生物物理分選的高通量適配，再到親和分選的高特異性，不同方案各有適配場景，無優(yōu)劣之分。實驗者需根據(jù)細(xì)胞類型、分選目標(biāo)、純度要求與成本預(yù)算綜合判斷，必要時通過方案組合提升分選效果，既能滿足實驗需求，又能保留細(xì)胞天然狀態(tài)，為后續(xù)功能研究或應(yīng)用提供可靠的細(xì)胞材料。