分選型流式：如何分離目標(biāo)細(xì)胞

在科研實(shí)驗(yàn)（如細(xì)胞功能機(jī)制研究、基因編輯細(xì)胞篩選）與臨床相關(guān)制備（如細(xì)胞的細(xì)胞群體純化）場景中，常需要從復(fù)雜細(xì)胞混合物中獲取特定類型的目標(biāo)細(xì)胞——例如從外周血中獲取CD4+T細(xì)胞、從骨髓樣本中獲取造血干細(xì)胞，或從培養(yǎng)細(xì)胞中篩選出帶有特定熒光標(biāo)記的基因編輯細(xì)胞。分選型流式細(xì)胞儀憑借“在單細(xì)胞水平識別并分離目標(biāo)細(xì)胞”的能力，成為完成這類任務(wù)的主要工具。其分離過程并非單一操作，而是通過樣本預(yù)處理、信號識別、液滴分選、質(zhì)量驗(yàn)證等多環(huán)節(jié)協(xié)同，逐步從混合細(xì)胞中篩選出符合要求的目標(biāo)細(xì)胞，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)或應(yīng)用提供純化的細(xì)胞材料。

分選型流式細(xì)胞儀的分離功能，基于“先識別目標(biāo)細(xì)胞，再將其物理分離”的邏輯，主要依賴液滴形成與靜電偏轉(zhuǎn)技術(shù)，實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)細(xì)胞的定向收集。當(dāng)樣本通過進(jìn)樣系統(tǒng)進(jìn)入儀器后，會在鞘液的包裹下形成穩(wěn)定的細(xì)胞流，單個細(xì)胞依次通過激光檢測區(qū)。此時，儀器會根據(jù)預(yù)設(shè)的識別標(biāo)準(zhǔn)（如細(xì)胞表面標(biāo)志物的熒光信號、細(xì)胞大小與內(nèi)部結(jié)構(gòu)的散射光信號），對每個細(xì)胞進(jìn)行“身份判斷”——例如，若目標(biāo)細(xì)胞是表達(dá)CD4分子的T細(xì)胞，儀器會檢測細(xì)胞是否帶有CD4熒光抗體標(biāo)記的信號，同時結(jié)合CD3分子的熒光信號（確認(rèn)T細(xì)胞身份），篩選出同時滿足兩種信號的細(xì)胞。被判定為“目標(biāo)細(xì)胞”的細(xì)胞，在繼續(xù)隨細(xì)胞流移動時，會觸發(fā)儀器的液滴生成系統(tǒng)：細(xì)胞流在振動裝置的作用下，被切割成包含單個細(xì)胞的微小液滴。在液滴脫離細(xì)胞流之前，儀器會對其施加特定的電荷（正電荷或負(fù)電荷）；而非目標(biāo)細(xì)胞所在的液滴，則不被充電或施加中性電荷。當(dāng)帶電液滴進(jìn)入后續(xù)的靜電偏轉(zhuǎn)電場時，會在電場力的作用下向?qū)?yīng)的電極方向偏轉(zhuǎn)，落入預(yù)設(shè)的收集管中；中性液滴則沿直線下落，進(jìn)入廢液收集容器。通過這一過程，目標(biāo)細(xì)胞被從混合細(xì)胞中物理分離出來，完成初步純化。

分選型流式細(xì)胞儀能否有效分離目標(biāo)細(xì)胞，前期準(zhǔn)備工作至關(guān)重要——樣本狀態(tài)與識別標(biāo)準(zhǔn)的設(shè)定，直接影響后續(xù)分離的效率與獲得細(xì)胞的質(zhì)量。混合細(xì)胞樣本需先處理為“單細(xì)胞懸液”，避免細(xì)胞聚集影響分選——若細(xì)胞成團(tuán)，會導(dǎo)致多個細(xì)胞進(jìn)入同一液滴，無法實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞分離，還可能堵塞進(jìn)樣通道。預(yù)處理時，需根據(jù)樣本類型選擇合適的方法：外周血樣本需通過溶血處理去除紅細(xì)胞，同時保留白細(xì)胞的完整性；貼壁培養(yǎng)細(xì)胞需用胰酶等消化試劑解離，再通過輕柔吹打分散為單細(xì)胞；組織樣本則需先研磨或酶解為細(xì)胞懸液，再通過濾網(wǎng)（通常為30-40μm孔徑）過濾去除組織碎片。此外，需保證細(xì)胞在分選前具有良好活性——活性過低的細(xì)胞可能在分選過程中破裂，或無法滿足后續(xù)培養(yǎng)、功能實(shí)驗(yàn)的需求。通常會在樣本處理過程中加入含血清的緩沖液（如PBS+10%胎牛血清），維持細(xì)胞滲透壓與營養(yǎng)供給，同時避免使用對細(xì)胞有損傷的試劑（如高濃度洗滌劑）。為目標(biāo)細(xì)胞設(shè)定清晰的識別標(biāo)準(zhǔn)，也能確保儀器準(zhǔn)確區(qū)分目標(biāo)細(xì)胞與非目標(biāo)細(xì)胞，常用的識別方式是“熒光標(biāo)記+散射光信號”組合：熒光標(biāo)記通過特異性抗體結(jié)合目標(biāo)細(xì)胞表面的標(biāo)志物（如CD4、CD34），或利用細(xì)胞自身的熒光特性（如帶有GFP基因的編輯細(xì)胞），讓目標(biāo)細(xì)胞攜帶獨(dú)特的熒光信號，例如分離造血干細(xì)胞時，會用CD34熒光抗體標(biāo)記細(xì)胞，同時用CD45熒光抗體區(qū)分造血細(xì)胞與其他細(xì)胞，設(shè)定“CD45低表達(dá)+CD34陽性”為識別標(biāo)準(zhǔn)；散射光信號中，前向散射光（FSC）反映細(xì)胞大小，側(cè)向散射光（SSC）反映細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)復(fù)雜度，可輔助排除雜質(zhì)（如碎片的FSC/SSC信號較弱）或區(qū)分細(xì)胞類型（如粒細(xì)胞的SSC信號高于淋巴細(xì)胞）。設(shè)定識別標(biāo)準(zhǔn)時，需避免“非特異性標(biāo)記”的干擾——例如選擇抗體時，需確認(rèn)其只與目標(biāo)標(biāo)志物結(jié)合，不與其他細(xì)胞表面分子交叉反應(yīng)；同時通過陰性對照（未標(biāo)記的細(xì)胞）與陽性對照（已知的目標(biāo)細(xì)胞），調(diào)整熒光信號的閾值，確保儀器不會將非目標(biāo)細(xì)胞誤判為目標(biāo)細(xì)胞，也不會遺漏真正的目標(biāo)細(xì)胞。

分選型流式細(xì)胞儀的分選效果，可通過調(diào)整參數(shù)實(shí)現(xiàn)不同需求的平衡——例如追求高純度的目標(biāo)細(xì)胞，或追求更高的分選速度以獲取足夠數(shù)量的細(xì)胞，需針對性設(shè)置參數(shù)。儀器通常提供多種分選模式，主要差異在于液滴充電與偏轉(zhuǎn)的精度：純度優(yōu)先模式下，儀器會嚴(yán)格確保每個收集的液滴中只包含一個目標(biāo)細(xì)胞，通過提高液滴檢測的精度，減少非目標(biāo)細(xì)胞混入，這種模式適合對細(xì)胞純度要求高的場景，如后續(xù)進(jìn)行單細(xì)胞測序或單克隆培養(yǎng)；得率優(yōu)先模式下，儀器會適當(dāng)放寬液滴篩選標(biāo)準(zhǔn)，允許少量包含多個細(xì)胞的液滴被收集（只要其中含有目標(biāo)細(xì)胞），以盡可能獲取更多目標(biāo)細(xì)胞，這種模式適合目標(biāo)細(xì)胞比例較低、需要足夠數(shù)量用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的場景，如從大量外周血中分離稀有干細(xì)胞；速度優(yōu)先模式通過提高細(xì)胞流速度與液滴生成頻率，提升單位時間內(nèi)的分選數(shù)量，適合樣本量大、需快速完成分選的場景，但需在速度與純度/得率之間尋找平衡。液滴從“信號識別”到“帶電偏轉(zhuǎn)”存在時間差，需通過校準(zhǔn)確保目標(biāo)細(xì)胞所在的液滴能準(zhǔn)確落入收集管——若延遲時間設(shè)置不當(dāng)，可能導(dǎo)致目標(biāo)細(xì)胞隨廢液流失，或非目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)入收集管。校準(zhǔn)通常使用標(biāo)準(zhǔn)熒光微球（大小與細(xì)胞相近，帶有穩(wěn)定熒光信號）：將微球樣本注入儀器，儀器檢測到微球信號后，調(diào)整延遲時間，觀察微球是否準(zhǔn)確落入收集管；通過多次調(diào)整，直到收集管中微球的回收率達(dá)到預(yù)期（通常需超過90%），且廢液中微球數(shù)量極少，此時的延遲時間即為參數(shù)。分選后的目標(biāo)細(xì)胞需在合適的條件下收集，以維持活性與功能：收集管需提前加入適量培養(yǎng)基或緩沖液，避免細(xì)胞直接撞擊管壁造成損傷，同時提供營養(yǎng)；若后續(xù)需進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，收集管需經(jīng)過無菌處理，避免污染；部分對溫度敏感的細(xì)胞，需在分選過程中對收集管進(jìn)行溫控（如置于4℃環(huán)境），減少溫度變化對細(xì)胞的影響。

分選完成后，需通過多項檢測驗(yàn)證目標(biāo)細(xì)胞的質(zhì)量，確保其符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)或應(yīng)用的要求，避免因分選偏差影響結(jié)果。通過流式細(xì)胞儀重新檢測收集到的細(xì)胞，可分析目標(biāo)細(xì)胞的比例——例如分離CD4+T細(xì)胞后，檢測CD4+CD3+細(xì)胞占總收集細(xì)胞的比例，判斷是否達(dá)到預(yù)期純度（通常科研場景需純度超過90%，部分臨床相關(guān)制備需更高比例）。若純度未達(dá)標(biāo)，需回溯檢查前期步驟：是否抗體標(biāo)記存在非特異性結(jié)合、是否分選參數(shù)設(shè)置不當(dāng)（如閾值過低導(dǎo)致非目標(biāo)細(xì)胞混入）。通過死活細(xì)胞染色（如臺盼藍(lán)染色、7-AAD染色）可檢測分選后細(xì)胞的活性，確保活性滿足后續(xù)需求（如培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)通常需活性超過80%）。若活性過低，需分析原因：是否樣本預(yù)處理時間過長、分選過程中細(xì)胞受到過度機(jī)械力（如進(jìn)樣壓力過大）、收集液成分不適宜等。若后續(xù)實(shí)驗(yàn)需細(xì)胞保持特定功能（如增殖、分泌細(xì)胞因子），需進(jìn)行功能驗(yàn)證：例如分離的T細(xì)胞，可通過體外培養(yǎng)觀察其增殖能力，或通過刺激實(shí)驗(yàn)檢測其細(xì)胞因子分泌情況；分離的造血干細(xì)胞，可通過集落形成實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其分化能力。功能驗(yàn)證能進(jìn)一步確認(rèn)分選過程未對細(xì)胞功能造成不可逆損傷。

分選型流式細(xì)胞儀的分離能力，已廣泛應(yīng)用于科研與臨床相關(guān)制備場景，為各類實(shí)驗(yàn)提供純化細(xì)胞材料：在免疫研究中，分離特定亞型的免疫細(xì)胞（如CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞），用于研究其對免疫應(yīng)答的調(diào)控作用；在基因編輯實(shí)驗(yàn)中，分離帶有熒光標(biāo)記（如GFP）的編輯細(xì)胞，排除未編輯細(xì)胞的干擾，獲得純合的編輯細(xì)胞群體；在細(xì)胞相關(guān)制備中，分離患者自體的特定細(xì)胞（如CAR-T細(xì)胞制備中的T細(xì)胞），純化后進(jìn)行體外培養(yǎng)與改造，再回輸至患者體內(nèi)。

分選型流式細(xì)胞儀分離目標(biāo)細(xì)胞的過程，是“識別—物理分離—質(zhì)量驗(yàn)證”的完整閉環(huán)：通過前期樣本處理與識別標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定，讓目標(biāo)細(xì)胞具備可被識別的特征；通過液滴形成與靜電偏轉(zhuǎn)技術(shù)，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)細(xì)胞的物理分離；通過后續(xù)質(zhì)量驗(yàn)證，確保分離出的細(xì)胞符合需求。這一過程的主要，在于“根據(jù)目標(biāo)細(xì)胞的特性設(shè)定合理參數(shù)”——不同細(xì)胞的大小、標(biāo)志物表達(dá)水平、樣本中比例不同，需調(diào)整的預(yù)處理方法、分選模式、收集條件也不同。只有充分理解細(xì)胞特性與儀器原理，才能通過分選型流式細(xì)胞儀，高效獲取符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)或應(yīng)用要求的目標(biāo)細(xì)胞，為科研突破與臨床相關(guān)技術(shù)發(fā)展提供支持。