臨床流式檢測標(biāo)準(zhǔn)化操作指南（二）

五、檢測流程標(biāo)準(zhǔn)化

1.樣本預(yù)處理

外周血樣本溶血：取100μL外周血樣本加入離心管，加入2mL溶血劑，輕輕顛倒混勻，室溫避光孵育5分鐘；孵育后以300×g離心5分鐘，棄上清液，保留細(xì)胞沉淀；用1mLPBS緩沖液（含0.5%牛血清白蛋白）重懸細(xì)胞，再次離心（300×g，5分鐘），棄上清（重復(fù)2次，去除殘留溶血劑）。

體液樣本濃縮：體液樣本以500×g離心10分鐘，棄上清，保留底部細(xì)胞沉淀；用0.5mLPBS重懸沉淀，通過30μm濾網(wǎng)過濾，去除組織碎片與大顆粒，收集過濾后的細(xì)胞懸液用于后續(xù)染色。

胞內(nèi)檢測樣本固定-破膜：需檢測胞內(nèi)分子（如轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞因子）時，樣本染色前需加入100μL固定劑（1%多聚甲醛），室溫避光孵育10分鐘；加入1mL破膜劑（0.1%皂素），輕輕混勻，室溫孵育15分鐘；破膜后以300×g離心5分鐘，棄上清，用破膜緩沖液重懸細(xì)胞，進(jìn)入染色步驟。

2.樣本染色操作

抗體加樣：根據(jù)檢測項目確定抗體組合與用量（如TBNK檢測需加入CD3-FITC、CD4-PE、CD8-APC、CD19-PE-Cy5、CD56-APC-Cy7抗體），按說明書推薦用量加樣（如5μL/抗體/100μL細(xì)胞懸液），避免抗體過量或不足（過量可能導(dǎo)致非特異性結(jié)合，不足則信號過弱）。

孵育條件：加樣后輕輕顛倒離心管3-5次，確保抗體與細(xì)胞充分混合；室溫（20-25℃）避光孵育15-20分鐘，孵育期間避免劇烈震蕩或陽光直射；孵育結(jié)束后加入1mLPBS，300×g離心5分鐘，棄上清，用0.5mLPBS重懸細(xì)胞，準(zhǔn)備上樣檢測。

3.儀器檢測操作

樣本上樣前準(zhǔn)備：將重懸后的細(xì)胞樣本管輕輕顛倒混勻，避免細(xì)胞沉降；通過30μm濾網(wǎng)再次過濾樣本（防止細(xì)胞團(tuán)堵塞進(jìn)樣針），過濾后立即上樣。

檢測參數(shù)設(shè)置：在操作軟件中調(diào)用對應(yīng)檢測項目的標(biāo)準(zhǔn)化模板（如“TBNK檢測模板”），模板中預(yù)設(shè)激光波長、熒光通道、進(jìn)樣速度（常規(guī)樣本為中速，每秒1000-2000個細(xì)胞）、數(shù)據(jù)采集量（至少采集10000個淋巴細(xì)胞事件）。

檢測過程監(jiān)控：啟動檢測后，觀察儀器運(yùn)行狀態(tài)，包括進(jìn)樣是否順暢、信號是否穩(wěn)定、有無報錯提示（如堵針、鞘液不足）；若出現(xiàn)堵針，立即暫停檢測，用清洗液反向沖洗進(jìn)樣針，通暢后重新上樣；檢測完成后，保存原始數(shù)據(jù)（FCS格式），不可刪除或修改。

六、數(shù)據(jù)分析與報告標(biāo)準(zhǔn)化

1.數(shù)據(jù)分析規(guī)范

標(biāo)準(zhǔn)化圈門策略：建立統(tǒng)一的圈門模板，以TBNK檢測為例，第一步通過前向散射光（FSC）與側(cè)向散射光（SSC）圈定淋巴細(xì)胞群體；第二步在淋巴細(xì)胞群體中，基于CD3表達(dá)圈定T細(xì)胞；第三步在T細(xì)胞中，通過CD4與CD8區(qū)分CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞；第四步基于CD3陰性群體，通過CD19、CD56區(qū)分B細(xì)胞與NK細(xì)胞，避免人工圈門的主觀差異。

數(shù)據(jù)審核要求：采用雙人審核機(jī)制，首審人員完成分析后，次審人員復(fù)核圈門位置、細(xì)胞亞群比例、信號強(qiáng)度是否合理；若發(fā)現(xiàn)異常（如淋巴細(xì)胞比例過低、某亞群信號缺失），需回溯樣本處理過程（如是否溶血過度、抗體是否漏加），必要時重新檢測。

2.報告生成規(guī)范

報告內(nèi)容：報告需包含患者基本信息（姓名、性別、年齡、病歷號）、檢測項目、樣本類型與采集時間、檢測日期、儀器型號、檢測結(jié)果（細(xì)胞亞群比例，保留2位小數(shù)）、參考范圍（按年齡、性別區(qū)分，如成人CD4+T細(xì)胞參考范圍25%-50%）、質(zhì)量控制結(jié)果（室內(nèi)質(zhì)控品本次檢測值與參考值對比）、報告審核人簽字與報告時間。

結(jié)果解讀原則：報告中只呈現(xiàn)客觀檢測結(jié)果，不添加臨床診斷建議；若結(jié)果超出參考范圍，需標(biāo)注“結(jié)果異常”，并提示“請結(jié)合臨床癥狀由醫(yī)師綜合判斷”；避免使用模糊表述（如“結(jié)果可疑”），需明確說明異常類型（如“CD4+T細(xì)胞比例降低”）。

七、質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)化

1.室內(nèi)質(zhì)量控制

質(zhì)控品使用：每日開展檢測前，需檢測室內(nèi)質(zhì)控品（如商品化淋巴細(xì)胞亞群質(zhì)控品），按常規(guī)樣本流程處理與檢測，記錄質(zhì)控結(jié)果（如CD3+T細(xì)胞比例、CD4+/CD8+比值）。

質(zhì)控判斷標(biāo)準(zhǔn)：建立質(zhì)控圖，以質(zhì)控品各指標(biāo)的歷史均值為中心，設(shè)定控制范圍（均值±2個標(biāo)準(zhǔn)差）；若本次質(zhì)控結(jié)果在控制范圍內(nèi)，視為“在控”，可開展臨床樣本檢測；若結(jié)果超出控制范圍（失控），需立即暫停檢測，排查原因（如試劑失效、儀器未校準(zhǔn)、操作失誤），解決問題后重新檢測質(zhì)控品，合格后方可恢復(fù)檢測。

質(zhì)控記錄保存：每日質(zhì)控結(jié)果需錄入質(zhì)控管理系統(tǒng)，記錄日期、質(zhì)控品批號、檢測人員、結(jié)果、是否失控、失控處理措施，記錄保存期限不少于3年。

2.室間質(zhì)量評價

參與要求：實(shí)驗(yàn)室需定期（至少每年2次）參加國家或省級臨床檢驗(yàn)中心組織的流式檢測室間質(zhì)量評價（EQA），按要求接收EQA樣本，在規(guī)定時間內(nèi)完成檢測并上報結(jié)果。

結(jié)果處理：EQA結(jié)果反饋后，對比本實(shí)驗(yàn)室結(jié)果與所有參與實(shí)驗(yàn)室的均值，若差異較大（如超出允許誤差范圍），需分析原因（如檢測流程與標(biāo)準(zhǔn)流程不符、校準(zhǔn)物未溯源），制定整改措施（如優(yōu)化圈門策略、更換校準(zhǔn)物），并驗(yàn)證整改效果。

八、廢棄物處理與安全規(guī)范

1.廢棄物分類處理

生物廢棄物：使用后的樣本管、吸頭、濾網(wǎng)等含生物樣本的廢棄物，需放入醫(yī)療垃圾袋（黃色），密封后由專業(yè)醫(yī)療廢棄物處理機(jī)構(gòu)收集，經(jīng)高壓滅菌后處置；禁止與生活垃圾混放。

化學(xué)廢棄物：廢棄的熒光抗體、固定劑、破膜劑等化學(xué)試劑，需按成分分類收集（如含重金屬的試劑單獨(dú)存放），標(biāo)注廢棄物名稱、產(chǎn)生日期，由具備資質(zhì)的機(jī)構(gòu)回收處理；鞘液、清洗液等無害廢液可直接排入實(shí)驗(yàn)室污水系統(tǒng)。

2.人員安全防護(hù)

操作防護(hù)：操作人員需穿戴一次性防護(hù)服、手套、口罩，必要時佩戴護(hù)目鏡；樣本處理時避免樣本飛濺，若皮膚接觸樣本，需立即用75%乙醇擦拭，再用流動水沖洗。

儀器清潔與消毒：檢測結(jié)束后，用75%乙醇擦拭儀器進(jìn)樣倉、樣本架；每周對儀器液流系統(tǒng)進(jìn)行深度清潔，用含0.1%次氯酸鈉的清洗液沖洗進(jìn)樣管路，防止生物污染。

九、記錄與追溯管理

實(shí)驗(yàn)室需建立完整的檢測記錄體系，包括樣本接收記錄、試劑耗材使用記錄、儀器校準(zhǔn)記錄、檢測操作記錄、數(shù)據(jù)分析記錄、質(zhì)量控制記錄、報告審核記錄等，所有記錄需清晰、可追溯，保存期限不少于5年（含電子記錄與紙質(zhì)記錄）。若臨床出現(xiàn)結(jié)果質(zhì)疑或糾紛，需能通過記錄回溯檢測全流程，包括樣本來源、試劑批次、儀器狀態(tài)、操作人員、數(shù)據(jù)分析過程等，確保檢測過程的可追溯性與合規(guī)性。