流式細胞儀的技術(shù)迭代之——從傳統(tǒng)流式到成像流式

在流式細胞儀的發(fā)展歷程中，傳統(tǒng)流式憑借高通量、多參數(shù)分析能力，為細胞研究打開了微觀世界的大門。但傳統(tǒng)流式只能通過光信號獲取細胞的物理與分子特征數(shù)據(jù)，無法直觀呈現(xiàn)細胞形態(tài)及標志物在細胞內(nèi)的分布情況，這一局限在需要結(jié)合形態(tài)判斷細胞特性的場景中顯得尤為明顯。而成像流式的出現(xiàn)，通過整合“流式分析”與“顯微成像”技術(shù)，實現(xiàn)了“看得到細胞形態(tài)”的關(guān)鍵突破，既保留傳統(tǒng)流式的高通量優(yōu)勢，又能獲取細胞的可視化圖像信息，為細胞分析提供了更多維度的視角。

一、傳統(tǒng)流式的局限：“知其特征，未見其形”

傳統(tǒng)流式細胞儀的中心工作模式，是讓細胞逐個通過激光檢測區(qū)，通過捕捉散射光與熒光信號，分析細胞的大小、內(nèi)部復雜度及分子標志物表達情況。這種模式下，研究人員能獲得大量細胞的量化數(shù)據(jù)，例如某一細胞群體中CD4+細胞的比例、細胞周期各階段的分布等，但始終無法直接觀察到細胞的實際形態(tài)——是圓形還是不規(guī)則形？細胞是否存在顆粒異常聚集？熒光標志物是分布在細胞膜表面還是細胞質(zhì)內(nèi)？這些與形態(tài)相關(guān)的信息，往往對判斷細胞功能或狀態(tài)至關(guān)重要，卻難以通過傳統(tǒng)流式獲取。

例如，在分析免疫細胞活化狀態(tài)時，傳統(tǒng)流式可檢測到細胞表面CD69（活化標志物）的表達量，但無法判斷CD69是否在細胞表面呈簇狀分布（這一形態(tài)特征與細胞活化程度直接相關(guān)）；在檢測細胞凋亡時，傳統(tǒng)流式能通過AnnexinV/PI雙染區(qū)分凋亡細胞與活細胞，卻無法觀察到凋亡細胞特有的形態(tài)變化（如細胞核固縮、細胞皺縮）。這種“只聞其聲，未見其形”的局限，使得傳統(tǒng)流式在需要結(jié)合形態(tài)與分子特征綜合判斷的場景中，難以提供完整的分析依據(jù)。

同時，傳統(tǒng)流式對“異常信號”的判斷也存在不足。當檢測到某一細胞的熒光信號異常時，傳統(tǒng)流式無法確定信號來源——是細胞本身的特異性表達，還是細胞碎片、雜質(zhì)的干擾，或是細胞聚集導致的信號疊加？由于缺乏形態(tài)圖像佐證，研究人員只能通過數(shù)據(jù)間接推斷，可能導致結(jié)果誤判。例如，傳統(tǒng)流式檢測中，細胞碎片的散射光信號可能與小細胞相似，若碎片攜帶非特異性熒光，易被誤判為低表達某標志物的小細胞，影響分析準確性。

二、成像流式的突破：“既獲數(shù)據(jù)，又見其形”

成像流式的中心創(chuàng)新，在于在傳統(tǒng)流式的基礎(chǔ)上，引入了“成像系統(tǒng)”——通過在檢測通道中加入高分辨率光學成像模塊，當細胞通過激光檢測區(qū)時，不只能像傳統(tǒng)流式一樣收集散射光與熒光信號，還能同步拍攝細胞的明場圖像（觀察細胞整體形態(tài)）與熒光圖像（觀察標志物的空間分布）。這種“數(shù)據(jù)+圖像”的雙重獲取模式，徹底改變了傳統(tǒng)流式“只測數(shù)據(jù)，不見形態(tài)”的局限，實現(xiàn)了細胞分析從“量化”到“量化+可視化”的跨越。

成像流式的檢測流程中，細胞通過檢測區(qū)時，激光激發(fā)產(chǎn)生的散射光與熒光信號會被探測器捕捉，轉(zhuǎn)化為量化數(shù)據(jù)；同時，高速相機（幀率可達數(shù)千幀/秒）會同步拍攝細胞的明場圖像與多通道熒光圖像，圖像分辨率可達0.3μm/像素，足以清晰呈現(xiàn)細胞的細微形態(tài)特征——如細胞核的大小與形狀、細胞質(zhì)內(nèi)顆粒的分布、細胞是否存在偽足等。這種“數(shù)據(jù)+圖像”的結(jié)合，讓細胞分析的結(jié)果更具說服力。例如，在研究藥物對細胞的影響時，傳統(tǒng)流式可檢測到細胞周期的變化，而成像流式不只能獲得細胞周期數(shù)據(jù)，還能通過圖像觀察到藥物處理后細胞是否出現(xiàn)多核、巨細胞等形態(tài)異常，從而更各個地評估藥物對細胞的作用效果。

傳統(tǒng)流式只能檢測熒光標志物的總表達量，無法判斷標志物在細胞內(nèi)的分布位置；而成像流式通過熒光成像，能清晰呈現(xiàn)標志物的空間分布——是位于細胞膜、細胞質(zhì)，還是細胞核？是否存在極性分布或簇狀聚集？這些分布特征往往與細胞功能密切相關(guān)，為深入理解細胞生理病理過程提供了關(guān)鍵線索。

例如，在分析轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的活化時，NF-κB在靜息狀態(tài)下位于細胞質(zhì)，活化后會轉(zhuǎn)移至細胞核。傳統(tǒng)流式可檢測到細胞內(nèi)NF-κB的總熒光強度，卻無法區(qū)分其在細胞質(zhì)與細胞核中的分布；而成像流式通過熒光圖像，能直接觀察到NF-κB是否進入細胞核，甚至通過圖像分析軟件量化細胞核內(nèi)NF-κB的熒光強度占比，更準確地判斷細胞的活化狀態(tài)。在免疫細胞研究中，成像流式還能觀察到T細胞受體（TCR）與抗原呈遞細胞表面MHC分子的結(jié)合情況（是否呈簇狀分布），為研究免疫突觸形成機制提供可視化證據(jù)。

憑借形態(tài)圖像的佐證，成像流式能有效解決傳統(tǒng)流式中“異常信號難以判斷”的問題。當檢測到熒光信號時，研究人員可通過同步拍攝的明場圖像，直接觀察信號來源——若圖像顯示為規(guī)則的細胞形態(tài)，且熒光信號與細胞輪廓重合，則為細胞的特異性信號；若圖像顯示為不規(guī)則的碎片形態(tài)，或熒光信號與細胞輪廓不匹配，則可判斷為干擾信號，在后續(xù)分析中排除。

例如，在檢測外周血中的循環(huán)細胞（CTC）時，傳統(tǒng)流式可能將攜帶非特異性熒光的細胞碎片誤判為CTC；而成像流式通過明場圖像觀察細胞形態(tài)（CTC通常呈上皮樣形態(tài)，有完整細胞核），結(jié)合熒光圖像（CTC表達CK，而碎片不表達），可精確區(qū)分CTC與細胞碎片，減少誤判。在分析細胞聚集信號時，成像流式的圖像能清晰顯示細胞是否存在聚集，若為聚集細胞，可通過軟件算法將其拆分或標記為無效數(shù)據(jù)，避免因細胞聚集導致的信號疊加干擾。

三、成像流式的應用拓展：從基礎(chǔ)研究到臨床檢測

“看得到細胞形態(tài)”的突破，讓成像流式在多個領(lǐng)域的應用中展現(xiàn)出獨特價值，彌補了傳統(tǒng)流式的不足，拓展了流式分析的應用場景。

在基礎(chǔ)研究領(lǐng)域，成像流式為細胞生物學、免疫學等學科提供了新的研究工具。例如，在細胞自噬研究中，成像流式可通過熒光圖像觀察自噬體（標記有LC3蛋白）的數(shù)量與分布，結(jié)合量化數(shù)據(jù)（自噬體熒光強度），更各個地分析自噬水平；在微生物研究中，成像流式能觀察細菌的形態(tài)（如球菌、桿菌），同時檢測細菌表面抗原的表達，實現(xiàn)細菌的分型與功能分析。

在臨床檢測領(lǐng)域，成像流式為疾病診斷與監(jiān)測提供了更精確的依據(jù)。例如，在血液疾病診斷中，成像流式可觀察白血病細胞的形態(tài)特征（如細胞核形態(tài)異常、細胞質(zhì)顆粒增多），結(jié)合表面標志物檢測，更準確地進行疾病分型；在自身免疫病檢測中，成像流式能觀察免疫復合物在細胞表面的分布情況，輔助判斷疾病活動度。此外，在藥物研發(fā)領(lǐng)域，成像流式可同時評估藥物對細胞形態(tài)（如是否導致細胞凋亡形態(tài)）與分子標志物（如是否抑制某信號通路蛋白表達）的影響，加速藥物篩選與作用機制研究。

四、技術(shù)迭代的意義：從單一分析到多維整合

從傳統(tǒng)流式到成像流式的技術(shù)迭代，并非簡單的功能疊加，而是實現(xiàn)了細胞分析從“單一量化”到“量化+形態(tài)+空間分布”的多維整合。這種整合讓細胞分析不再局限于數(shù)據(jù)層面的推斷，而是能通過可視化圖像直接驗證分析結(jié)果，為研究人員提供更各個、更可靠的信息。

同時，成像流式的發(fā)展也保留了傳統(tǒng)流式的中心優(yōu)勢——高通量。傳統(tǒng)顯微鏡成像需要逐視野觀察細胞，分析速度慢，難以處理大量樣本；而成像流式能以每秒數(shù)十至數(shù)百個細胞的速度，同時完成數(shù)據(jù)采集與圖像拍攝，兼顧高通量與可視化，滿足大規(guī)模樣本分析的需求。這種“高通量+可視化”的結(jié)合，讓成像流式在需要處理大量樣本且需形態(tài)佐證的場景中（如臨床批量檢測、藥物高通量篩選），展現(xiàn)出不可替代的價值。

成像流式通過“看得到細胞形態(tài)”的突破，彌補了傳統(tǒng)流式的局限，為細胞分析打開了新的維度。它既延續(xù)了流式技術(shù)的高通量優(yōu)勢，又融入了顯微成像的可視化能力，實現(xiàn)了“數(shù)據(jù)與圖像”的協(xié)同分析，為生命科學研究與臨床檢測提供了更強大的工具。隨著成像分辨率的提升、圖像處理算法的優(yōu)化，成像流式還將在更多領(lǐng)域發(fā)揮作用，推動細胞分析技術(shù)向更各個、更深入的方向發(fā)展。